Prevalencia y grado de parasitación por Myocoptes musculinus en ratones NMRI, C57Bl/6 y Balb/c, en base a cepa, edad y sexo

Fuentes,  Mónica ⁽¹⁾; Sánchez, Caridad ⁽²⁾; Quilez, Joaquin ⁽²⁾

⁽¹⁾Decanato de Ciencias Veterinarias Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado, Barquisimeto. Edo Lara.Venezuela. Email: monicafuentes@ucla.edu.ve

⁽²⁾ Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad de Zaragoza. Zaragoza. España.

RESUMEN

A fin de analizar la prevalencia y grado de parasitación en ratones de laboratorio NMRI, C57B1/6 y Balb/c convencionales producidos en el Bioterio de la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado (UCLA) en Barquisimeto (Venezuela), y su correlación con la edad y sexo del hospedador, se seleccionaron 50 ratones por cada cepa y sexo, 10 por edad (3, 5, 7, 9 y 14 semanas) (N=300). Se recogieron por duplicado muestras de piel (cuello, dorso-lumbar y ano), mediante técnica de celofán realizando el recuento del número de huevos, ninfas y adultos de ectoparásitos por cm². Solo se identificó la presencia de Myocoptes musculinus localizado preferentemente en  dorso independientemente del sexo del animal, con frecuencia superior en ratones C57B1/6 (86%) que en los NMRI (63%) y Balb/c (38%)  (P<0,0001). Se recomienda tomar en cuenta las variables cepa, edad y sexo para establecer los controles sanitarios en estas cepas de ratones de laboratorio.

Palabras clave: Myocoptes, NMRI, C57Bl/6, Balb/c

 ABSTRACT

The current study was designed to analyze the prevalence and infection intensity by different parasites in conventional NMRI, C57B1/6 and Balb/c laboratory mice produced in the animal research facilities of the Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado (UCLA) in Barquisimeto (Venezuela), as well as its correlation with the age and sex of the host. For that purpose, a total of 50 mice for each strain and sex were selected and divided into five age groups of ten each (3, 5, 7, 9 and 14 weeks) (N = 300). Samples of the skin (neck, back-lumbar and anal) were collected by duplicate using the cellophane thick smear technique and the number of eggs, nymphs and adults of ectoparasites per cm² was estimated. Myocoptes musculinus was the only parasite identified and mostly located in the back at both male and female individual. Infection rates were higher in C57B1/6 (86%) than NMRI (63%) or Balb/c (38%) mice (P<0,0001). It is recommended that strain, age and sex data should be taken into account to design a sanitary program for these strains of laboratory mice.

Key words: Myocoptes, NMRI, C57Bl/6, Balb/c

I. INTRODUCCION

Los roedores de laboratorio son parasitados por numerosas especies de artrópodos ectoparásitos. Entre los más comunes en el ratón, se encuentran diversas especies de ácaros (Myobia musculi, Radfordia affinis, Myocoptes musculinus Ornithonyssus bacoti, Trichoecius romboutsi) y piojos (Poliplax serrata), (Percy y Barthold, 1993; Flynn, 1973; Malcolm y O’Donoghue, 1984). Estas especies de distribución cosmopolita, pueden llegar a parasitar a la totalidad  de las colonias y en muchos casos los animales son asintomáticos, ya que las manifestaciones clínicas, dependen del grado de infestación, edad y sexo de los animales y otros factores individuales como es la receptividad (Dawson y col, 1986).

Numerosas cepas de ratones, tanto consanguíneos, como no consanguíneos, líneas transgénicas, entre otras están parasitadas por M. musculinus (Conole y col, 2003). Se reporta la presencia de acaros incluso en animales producidos bajo barreras (15%) y mayor aún en convencionales (40%) (Carty, 2008). La edad se considera ejerce un efecto sobre la presencia de acaros en los ratones de laboratorio, siendo los de 4 semanas los mas propensos, disminuyendo con la edad; igualmente el sexo, siendo mayor en las hembras (Rice y col, 2013).

La presencia de ectoparasitos, es de sumo interés, puesto que son numerosas las alteraciones que  producen y las posibles consecuencias en la experimentación.  A este respecto, cabe señalar la inducción de IgE en ratones (Inagaki y col, 1985) y ratas (Gilabert y col, 1990) y reacciones de hipersensibilidad en ratones por exposición a alimento contaminado con ácaros (Motegi y col, 1993). Sugiura y col, (2002) compararon la reacción de hipersensibilidad en la piel causada por Myocoptes musculinus, entre ratones NC/F y Balb/c, indicando que no se produce reacción de hipersensibilidad en los ratones Balb/c, mientras que sí observaron  reacción en 87,5% de los ratones NC/F. Los ratones C57Bl/6 son propensos a desarrollar reacciones de hipersensibilidad a ácaros como Myobia musculi, presentando comúnmente dermatitis ulcerativa idiopática. Puede producirse hiperqueratosis y contaminación bacteriana secundaria (Goodwin y col, 2000).

La técnica diagnóstica se considera esencial, diversos autores refieren la técnica de celofan o cinta adhesiva como la de mayor sensibilidad entre las técnicas para uso continuo. Metcalf y col. (2011), reportan un 100% de sensibilidad de ésta prueba, en comparación con el raspado de piel (57%). Rice y col, (2013), recomiendan la técnica de PCR en animales adultos y colonias donde la infestación es leve y en animales jóvenes el uso de la técnica de celofan.

            El pesente trabajo se realizó con el objetivo de analizar  la prevalencia y grado de parasitación por ectoparásitos en ratones de laboratorio, en base a la cepa (NMRI, C57B1/6 y Balb/c), edad y sexo de los animales.

II. METODOLOGIA

            Se realizo una investigación analítica, con un diseño de campo longitudinal, en los ratones de las colonias procedentes del  Bioterio Central de la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado (UCLA), mantenidos en condiciones convencionales con un promedio de temperatura (Tº) de 22-27ºC y humedad relativa (HR) de 45-65%, parámetros registrados por sala. Se cumple prsoceso de lavado y desinfección dos veces por semana. El lecho es a base de tusa de maíz, de fabricación propia y los animales reciben alimento concentrado comercial al que se realizan examenes periódicos (Ratarina), así como agua filtrada y clorada.

El tamaño de la muestra se calculo en base a la fórmula de Thursfield, (1990) para poblaciones pequeñas, con una prevalencia esperada del 50%,  intervalo de confianza  de 95% y un error del 10%, seleccionando asi, 10 animales de cada sexo y de cada edad (3, 5, 7, 9 y 14 semanas), por cada una de las cepas (NMRI, C57Bl/6, Balb/c), para un total de 300 ratones.

El estudio parasitológico se realizo con muestras obtenidas de animales vivos, recolectando por duplicado muestas dérmicas a traves de la tecnica de celofán en  la zona de la nuca y dorso del cuello, dorso-lumbar  y  anal, realizando el recuento del número de huevos, ninfas y adultos de ectoparásitos por cm².

  Los datos fueron analizados a traves de la prueba Chi-cuadrado. Para comparar el grado de parasitación, se empleo estadistica no paramétricas, U de Mann-Whitney para dos grupos con muestras independientes y Kruskal-Wallis para comparación de más de dos grupos con diferencias significativas (P<0,05) o altamente significativas (P<0,01) en relación con el sexo, cepa y edad de los animales. Para la correlación entre la presencia de Myocoptes,  el  sexo y edad de los animales se empleo correlación de Spearman y para determinar el efecto individual y combinado de las  distintas variables, se empleo un análisis multivariable o factorial. Los datos se  estructuraron en rangos, basados en los valores minimos y máximos obtenidos, considerando una infestación: leve (1-3 y  1-15), moderada (4-6 y 16-30), alta (>6 y >30) de adultos + ninfas/cm² y de 1-15 huevos/ cm² respectivamente.

III. RESULTADOS

Los ratones NMRI y Balb/c, utilizados en el presente estudio no presentaban signos clínicos. En los C57Bl/6  se observaron ligeras alopecias muy comunes en esta cepa. Mediante el examen microscópico se  identificó  Myocoptes musculinus  en las tres cepas de ratones.

La prevalencia de parasitación por M. musculinus resultó más alta (P<0,0001) en ratones C57B1/6 (86%) que en los NMRI (63%) y Balb/c (38%)  (Tabla 1 y Figura 1). Por otra parte, tanto en ratones NMRI como en Balb/c la prevalencia de parasitación por M. musculinus es mayor en machos (85% y 50%, respectivamente)  que en hembras (40% y 25%) (P<0,05). Resultados similares  se obtuvieron en ratones C57Bl/6, con 86% de animales parasitados aunque sin diferencias significativas entre sexo. La prevalencia de parasitación más baja se produjo en ratones Balb/c (38%) (Tabla 1).

Tabla 1. Prevalencia de Myocoptes musculinus. Ratones  NMRI, C57Bl/6 y Balb/c. Sexo y edad  de los animales

Los resultados obtenidos, indican que la prevalencia de parasitación por M. musculinus  varía en relación con  la cepa  y edad de los animales. Por lo que respecta  a la  edad, a las 3 semanas se produce la prevalencia más alta tanto en  C57B1/6 (100%), como NMRI (80%). En los C57B1/6, desciende la prevalencia  del 100% a las 3 semanas, hasta 70% a las 14 semanas (P<0,05). Por el contrario el porcentaje de ratones NMRI parasitados se reduce en los animales de 6 y 9 semanas para incrementarse nuevamente a las 14 semanas (75%), aunque sin diferencias significativas. El mayor porcentaje de parasitación en ratones Balb/c se observa a las 9 semanas (65%), con diferencias significativas con respecto a los valores obtenidos  en  animales  más jóvenes (P<0,05).

Ratones NMRI

En los ratones NMRI, M. musculinus se localiza preferentemente en el dorso  de machos y hembras independientemente de la edad (P<0,01), pero destaca en los machos de 14 semanas, en los que el 100% tienen ácaros en la zona dorsal, mientras que se ha aislado en el 50% de las hembras. En ambos sexos, los ácaros se localizan preferentemente en la zona dorsal, seguida de la lumbar y el porcentaje de animales en los que se aisla en la zona anal es escaso comparativamente con las anteriores (18% y 5%),  (Tabla 2).

Tabla 2.  Prevalencia y localización de  M. musculinus. Ratones NMRI.  Sexo y edad  de los animales

Tabla 3. Grado  de  parasitación por M. Musculinus (adultos/ huevos)  en  diversas zonas corporales (dorsal, lumbar, anal). Ratones NMRI. Sexo y edad de los animales

A= adultos + ninfas; H= huevos

En el dorso, se concentra el mayor número de ácaros tanto adultos y/o ninfas como huevos de M. musculinus, circunstancia que se repite en todos los grupos independientemente del sexo y la edad, destacando el número de huevos en machos  de 14 semanas (20,5±15,3) (Tabla 3). En las hembras, tanto la prevalencia como el grado de parasitación son inferiores a los machos, y la infestación más alta (por adultos, ninfas  y huevos), se produce  a las  3 semanas de edad (P<0,001) (Figura 2 y 3).

El análisis estadístico indica diferencias significativas entre sexo tanto en el numero de adultos+ninfas como de huevos (P<0,001). El  análisis factorial indica efecto del  sexo y la edad de los animales, tanto de forma individual como combinada, sobre el grado de parasitación  por M. musculinus en el  dorso (P<0,001),  pero no en la  zona anal.   

Ratones C57Bl/6

En los ratones C57B1/6 los huevos, ácaros adultos+ninfas de  M. musculinus  se localizan preferentemente en las zonas dorsal y lumbar tanto de  machos como  hembras (P<0,0001) de todas las edades (P<0,05), exceptuando las hembras de 6 semanas, aunque  sin  diferencias significativas (Tabla 4). El mayor número de ácaros adultos+ninfas y huevos de M. musculinus con un máximo de 40,5±12 huevos  se observa  en las hembras de 3 semanas se edad  (Tabla 5).

El análisis de los resultados indica diferencias significativas en función de la edad de los animales y aislamiento de huevos en dorso (P<0,0001),  zona lumbar (P<0,001) y anal (P<0,0001) y presencia de ácaros adultos en la zona  anal (P<0,0001). Al comparar los resultados en ambos sexos, las diferencias únicamente son significativas en relación con  el aislamiento en la zona anal de las hembras (P<0,0001) (Tabla 4).

 El análisis factorial indica que existe efecto del sexo y la edad sobre la presencia de huevos en ano (P<0,0001) y de la edad con respecto a la presencia de huevos en  dorso (P<0,0001).

Tabla 4. Prevalencia y localización de M. musculinus. Ratones C57Bl/6. Sexo y edad  de los animales

Tabla 5. Grado  de parasitación por M. Musculinus (adultos/huevos)  en diferentes zonas corporales (dorsal, lumbar y anal). Ratones C57Bl/6. Sexo y edad de los animales

A= adultos + ninfas; H= huevos

En términos generales, la prevalencia es superior en las hembras, aunque el grado de parasitación es mayor en los machos. En ambos sexos existe un alto grado de infestación, alcanzando  30% por ácaros adultos en la zona lumbar a las 6 semanas  y  superiores a 40% en el caso de  huevos en el dorso a las 3 y 6 semanas de edad. La prevalencia más alta se produce en animales jóvenes, de 3 y 6 semanas (Figura 4 y 5).

Ratones Balb/c

M. musculinus se localiza preferentemente en el dorso en ambos sexos independientemente de la edad y las diferencias son estadísticamente significativas, al comparar la presencia de ácaros en  las zonas dorsal y anal (P<0,005) (Tabla 6). En  la zona dorsal  el grado de parasitación es mayor, tanto por adultos+ninfas o huevos de M. musculinus,  con un promedio máximo  de ácaros por ratón de 6,2 adultos y 20,2 huevos en machos de 6 semanas (Tabla 7).

Tabla 6. Prevalencia y localización de M. musculinus. Ratones Balb/c. Sexo y edad  de los animales

Existen diferencias significativas en la edad de los animales con respecto al grado de parasitación por ácaros adultos y huevos localizados tanto en la zona dorsal como lumbar (P<0,0001) y no existe esta relación cuando se localizan en la zona anal.  En  los machos el grado parasitación por huevos en el dorso (P<0,05) y por adultos en la zona lumbar (P<0,001) es significativamente mayor que en hembras.

Tabla 7. Grado de parasitación por M. musculinus (adultos/ huevos)  en diferentes zonas corporales (dorsal, lumbar y anal).  Ratones Balb/c. Sexo y edad  de los animales

A= adultos + ninfas; H= huevos

El análisis factorial confirma  la relación  significativa  que existe entre el  sexo de los animales y la presencia de huevos de M. musculinus en la zona dorsal  (P<0,005) y de ácaros adultos en la  lumbar (P<0,001), así como el efecto de la edad  sobre la presencia de ácaros adultos y huevos en la zona  dorsal y huevos en la anal (P<0,0001). En  Balb/c, tanto la prevalencia como el grado de parasitación es mayor en machos que en hembras independientemente de la edad de los animales y de la localización de los ácaros (Figuras 6 y 7), aunque individualmente, el grado de parasitación es mayor en los animales de 6 semanas de edad  tanto  en machos como hembras.

Prevalencia  y grado de parasitación por Myocoptes musculinus. Ratones NMRI, C57Bl/6 y Balb/c

            La prevalencia de parasitación más alta se observo en ratones C57B1/6, seguidos de los NMRI y finalmente de los Balb/c y el grado de parasitación más alto por M. musculinus se detecto en  los C57B1/6, seguida de los Balb/c y finalmente de los NMRI, con diferencias significativas entre las tres cepas (P<0,0001). La prevalencia es más alta en machos que en hembras en los tres grupos, siendo la zona dorsal donde se localiza esta especie con mayor frecuencia e intensidad, sin que existan diferencias  estadísticamente significativas relacionadas con la edad de los animales.

El análisis factorial  indica que hay efecto individual de  la cepa  y el sexo, y combinado entre la edad y la cepa de los animales, sobre la presencia de M. musculinus animal (P<0,05 y P<0,01, respectivamente). La cepa combinada con el sexo ejercen un efecto significativo sobre la presencia de  huevos en el dorso (P<0,01) y zona anal  (P<0,0001); la cepa y la edad con la presencia de ácaros adultos y huevos en las tres zonas (P=0,0001); el sexo y la edad con la presencia de ácaros adultos y huevos en la zona anal y la combinación de cepa, sexo y edad, con la presencia de huevos en las zonas dorsal y lumbar  (P<0,0001) y  de los ácaros adultos en la zona  anal (P<0,0001).

 El análisis de Spearman establece correlación moderada entre la presencia de ácaros adultos y huevos dentro de cada zona analizada, es decir, entre adultos y huevos en la zona dorsal (r=0,523; P<0,0001), lumbar (r=0,678; P<0,0001) y anal (r=0,4932; P<0,0001).

VI. DISCUSION

            Según un estudio realizado por Carty (2008) en 80 Bioterios de los Estados Unidos, entre las especies parásitas más prevalentes en ratones (Mus musculus) se incluyen Myocoptes musculinus (25%), Myobia musculi (40%), sin embargo diferentes autores, consideran a Myocoptes musculinus como el ectoparásito más frecuente en ratones (Mus musculus) (Goodwin y col, 2000; Percy y Barthold, 1993). Bressan y col. (1997) en dos colonias en Sao Paulo, Brasil, reporta en una colonia 53.66% de Miobia musculi vs 71.95% de Myocoptes musculinus, mientras que en otra obtuvieron 87.01% y 20.78% respectivamente. Bicalho y col (2007), señalan en un estudio de 13 bioterios, 12 de ellos convencionales en Minas Gerais, 23.1% de M. musculi, 38.5% de M. musculinus y 15.4% de Radfordia affinis. A este respecto, se coincide en corroborar la alta prevalencia de infestación por Myocoptes, significativamente más frecuente en  ratones C57Bl/6 (86%) que en los NMRI (63%) o Balb/c (38%).

M. musculinus es un ácaro poco patógeno que vive en el pelo, sobre la superficie dérmica y se alimenta de secreciones dérmicas y linfa, por lo cual no produce lesiones visibles en los animales parasitados y las infestaciones suelen ser asintomáticas (Goodwin y col, 2000). No obstante, los signos clínicos en ratones pueden variar dependiendo de la cepa, edad, sexo y receptividad individual a estos ectoparásitos y en general se considera que los animales consanguíneos son los más receptivos (Dawson y col, 1986; Conole y col, 2003). Concretamente, diversos autores señalan que la cepa C57B1/6 es la más propensa a reacciones de hipersensibilidad tipo 1 por estos ácaros, seguida de la Balb/c (Jungmann y col, 1996a; Goodwin y col, 2000; Baker, 2007). Esta circunstancia ha sido corroborada, siendo son los  ratones C57B1/6 los más receptivos a la infestación por M. musculinus, con valores de prevalencia muy superiores. Asímismo, únicamente en ellos se observaron lesiones asociadas a la infestación, concretamente  ligeras alopecias en algunos de ellos.

Los resultados indican que Myocotes musculinus parasita con más frecuencia a los machos, contrario a lo reportado por Rice y col. (2013) y se localiza especialmente en la zona dorsal,  donde también se concentra el mayor número de adultos/ninfas y huevos. Este hallazgo coincide con las observaciones de Jungmann y col, (1996b), que señalan el dorso, nuca y zona escapular como localizaciones preferenciales, aunque Goodwin y col, (2000), también registran un gran número de ácaros en la zona inguinal. Metcalf y col. (2011) indican mayor porcentaje de positividad en la región inguinal, seguida de la nuca y el dorso. Sahinduran y col. (2010) señalan mayor receptividad en Balb/c y C57 de 1 a 3 meses. Rice  y col. (2013), especifican las 4 semanas de edad, como la etapa con mayor presencia de Myocoptes musculinus. Por el contrario, en el presente estudio  no se ha encontrado un patrón común en cuanto a la edad de máxima receptividad, que se fija en las 3 semanas en ratones C57Bl/6 y NMRI y 9 semanas en ratones Balb/c.

 CONCLUSION

            La receptividad a la infección por Myocoptes musculinus está relacionada con la cepa, edad y sexo de los ratones. Los C57Bl/6 son los más receptivos a la infección por M. musculinus, la cual se presenta primordialmente en el dorso del animal.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1.          Baker D. 2007. Parasites of rats and mice. Flynn’s parasites of laboratory animals. 2da Edición Ames (IA): Blackwell Publishing. 339-40.

2.          Bicalho K, Araújo F., Rocha R., Carvalho O. 2007. Sanitary profile in mice and rat colonies in laboratory animal houses in Minas Gerais: I - Endo and ectoparasites Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., 59, (6): 1478-1484.

3.          Bressan M., Calgaro G., Alexandre S., Marques T. 1997. Prevalence of ecto and endoparasites in mice and rats reared in animal houses. Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci. 34 (3):142-46.

4.          Carty A. 2008. Opportunistic infections of mice and rats: Jacoby and Lindsey Revisited. ILAR Journal. 49(3):272:76.

5.          Conole J., Wilkinson M., Mckellar Q. 2003. Some observations on the pharmacological properties of ivermectin during treatment of a mite infestation in mice. Contemp Top. Lab. Anim. Sci. 42(4):42-5.

6.          Dawson D., Whitmore S., Bresnahan J. 1986. Genetic control of susceptibility to mite-associated ulcerative dermatitis. Lab. Anim. Sci. 36:262-267.

7.          Flynn R. 1973. Parasites of laboratory animals. Iowa State University Press/Ames. Primera edición. EEUU.  884pp.

8.          Gilabert, A.; Salgado J.; Franch A.; Queralt J.; Torralba A. 1990. Specific IgG and IgE responses to Dermatophagoides pteronyssinus in Sprague-Dawley rats. Rev. Esp. Fisiol. 46:353-357.

9.          Goodwin B., Yarbrough L., Head K. 2000. Rats and mice: parasitic diseases. Lab. Anim. Med. And Sci. Series II. Universidad de Texas Houston. 30pp.

10.      Inagaki, N., Tsuruoka N., Goto S., Matsuyama T., Daikoku M., Nagai H., Koda A.1985. Immunoglobulin E antibody production against house dust mite, Dermatophagoides farinae, in mice. J. Pharmacobiodyn. 8:958-963. En: Homberger F. Iligen-Wilcke B., Jacobi K., Kraft V., Kunstyr I., Mahler M., Meyer H., Pohlmeyer-Esch G. 1999. Implications of infectious agents on results of animal experiments. Lab Ani. 33(1):39-87.

11.      Jungmann P., Freitas A., Bandeira A., Nobrega A., Coutinho A., Marcos M., Minoprio P. 1996b. Murine acariasis. II. Immunological dysfunction and evidence for chronic activation of Th-2 lymphocytes. Scand. J. Immunol. 43:604-612

12.      Jungmann P., Guenet J., Cazenave P., Coutinho A., Huerre M. 1996a. Murine acariasis. I. Pathological and clinical evidence suggesting cutaneous allergy and wasting syndrome in BALB/c mouse. Res. Immunol. 147:27-38

13.      Malcolm J., O’donoghue P. 1984. Patología de los animals de laboratorio. Diagnóstico y tratamiento. Editorial Acribia. Zaragoza. España. 305pp.

14.      Metcalf K., Rice K., Wrighten R., Watson J. 2011 Effect of sampling strategy on the detection of fur mites within a naturally infested colony of mice (Mus musculus). J. of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (3): 337-43.

15.      Motegi, Y., Morikawa A., Kuroume T. 1993. Influence of environmental mite antigen on anti-mite antibody production in mice. Int. Arch. Allergy Immunol. 102:81-6.

16.      Percy D., Barthold S. 1993. Pathology of laboratory rodents and rabbits. Iowa State University Press/Ames. Primera edición. EEUU.  229pp.

17.      Rice K., Albacarys L., Metcalf K., Perkins C., Henderson K., Watson J. 2013. Evaluation of diagnostic methods for Myocoptes musculinus according to age and treatment status of mice (Mus musculus). J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 52 (6): 773-81.

18.      Sahinduran S., Ozmen O., Haligur M., Yukari B. 2010. Severe Myocoptes musculinus infestation and treatment in laboratory mice. Ankara Univ. Vet. Fak. Derg. 57: 73-75.

19.      Sugiura K., Sugiura M., Hayakawa R., Shamoto M, Takahashi H. 2002. Study of match test reactions to Myocoptes musculinus (Kekuidani) of NC/F mice (atopic model mice). Exogenous Dermatology. 1:87-91.

20.      Thursfield M. 1990. Epidemiología veterinaria. Editorial Acribia. España. 232pp.

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