La Vitamina C y su Efecto Protector Hepático

Mendoza, Carmen¹; El Abed, Yajidy³; Márquez, Ysabel²;

Meléndez, Carmen; López de Ortega, Aura¹ y Matheus, Nyurky².

Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”.

Decanato de Ciencias Veterinarias. Unidad de Investigación en Ciencias Funcionales

“Dr. Haity Moussatché (UNIHM) ¹Área Biología Celular y Molecular. ²Área Fisiología Animal. ³Área Bioquímica.

carmenmendoza@ucla.edu.ve

RESUMEN

El hígado graso (HG) es una patología que afecta a los animales, lo que trae pérdidas económicas en la ganaderia. Los radicales libres (RL) están involucrados en el daño hepático producido por Etionina (ET). Se planteó como objetivo determinar el efecto protector de la vitamina C sobre el daño causado al ADN en hepatoesteatosis inducida por ET. Se utilizaron ratones hembras NMRI, divididos en: Control, ratones con HG, animales con HG más Vit.C y sólo conVit.C. Al grupo Vit.C se les administró s.c. 50 mg de Vit.C /30g de peso vivo/30 días y a los controles solo vehículo. El daño hepático se determinó midiendo los niveles de Triglicéridos (TG), Malondialdehido (MDA), Dienos Conjugados (DC) y el daño al ADN hepático, mediante el ensayo cometa. Se obtuvieron diferencias en los valores de la concentración de TG hepáticos: 0,281mg TG/mg proteínas para el grupo control; 4,046 mgTG/mg proteínas para el grupo HG; 0,671 mg TG/mg proteínas para el grupo HG+VitC y 0,194mg TG/mg proteínas para el grupo Vit.C. Así como para la concentración de nmoles de MDA/mg proteínas obteniéndose: 4,786 para grupo control, 15,292 para el grupo HG, 3,908 para el grupo HG+VitC y 3,802 para el grupoVit. C. En el caso de los DC se obtuvo 213,64 moles de DC/mg proteínas para el grupo control; 422,82 moles de DC/ mg proteínas para el grupo HG; 336,06 moles de DC/mg proteínas para el grupo Vit.C+HG y 194,00 moles de DC/mg proteínas para el grupo Vit. C. Los cometas se evaluaron midiendo la longitud de la cola, se obtuvo para el grupo Vit. C+HG un daño moderadamente bajo y para el grupo HG un daño mayor del ADN. Estos resultados sugieren que la Vit. C administrada bajo las condiciones experimentales de este estudio actúa como agente protector sobre el daño hepático.

 

Palabras claves: Hígado graso, estrés oxidativo, daño al ADN, Vitamina C.

 

 

ABSTRACT

Fatty liver is a disease that affects animals, which brings economic losses in livestock. The free radicals (FR) are involved in liver damage induced with Ethionine (ET). The objective was to determine the protective effect of vitamin C on DNA damage in hepatoesteatosis induced with ET. NMRI female mice were used, divided into: Control, HG, HG more Vit.C and Vit.C. The group were Vit.C given vìa s.c 50 mg of Vit.C / weight 30g / 30 days and single vehicle controls. Liver damage was determined by measuring the levels of triglycerides (TG), Malondialdehyde (MDA), Conjugated dienes (CD) and DNA damage using the comet assay. The results showed differences in the values of hepatic TG concentration: 0.281 mg TG / mg protein for the control group; 4,046 mgTG / mg protein for the HG group, 0.671 mg TG / mg protein for the group HG + VitC and 0.194 mg TG / mg protein for the group Vit.C. As for the concentration of MDA nmol / mg protein yielding: 4,786 for control group, 15,292 for the HG group, 3,908 for the group HG + VitC and 3,802 for grupoVit. C. In the case of DC obtained DC 213.64 moles / mg protein for the control group, 422.82 moles of DC / mg protein for HG group; DC 336.06 moles / mg protein for the group Vit. C + HG and DC 194.00 mol / mg protein for Vit group. C. Comets were evaluated by measuring the tail length was obtained for the group Vit. C + HG moderately low and damage to the HG group increased DNA damage. These results suggest that the Vit. C administered under the experimental conditions of this study acts as a protective agent for liver damage.

Keywords: fatty liver, oxidative stress, DNA damage, Vitamin C.

 

INTRODUCCIÓN

 

Se ha reportado que el hígado graso desencadena por lo general, un proceso de estrés oxidativo, que puede conllevar a la muerte celular (Lettéron y cols., 1996). El hígado graso (HG) o hepatoesteatosis puede ser de etiología metabólica, nutricional (Alpers y Isselbacher 1975) o farmacológica como el causado por la administración de antibióticos (Hautekecte 1995), etanol, tetracloruro de carbono y etionina, entre otros. Esta patología ha sido relacionada con la génesis de radicales libres, y en el HG inducido por etionina (ET) se observa un notable aumento de los mismos, indicativo de estrés oxidativo hepático (Aarsaether y cols., 1988, López-Ortega y col 1997).

El estrés oxidativo es un desbalance entre la producción de especies reactivas de oxigeno (ROS) y los sistemas de defensa antioxidante, enzimáticos o no, debido a carencia de vitaminas y minerales, procesos inflamatorios, deficiencia del sistema inmune, situaciones de ejercicio intenso y factores ambientales que impiden al organismo controlar la reacción en cadena de las ROS. Este desbalance interviene en procesos como la lipoperoxidación de las membranas y organélos celulares y en la peroxidación de ácidos nucleicos (Helmunt, 1985).

Es en esta situación de estrés oxidativo en la que se manifiestan las lesiones que producen los radicales libres, que reaccionan químicamente con lípidos, proteínas, carbohidratos y ADN en el interior de las células, y con componentes de la matriz extracelular, por lo que pueden desencadenar un daño irreversible que, si es muy extenso, puede llevar a la muerte celular (Galván y col., 2008). Los RL inducen peroxidación lipídica, lo que se puede evidenciar al observar la concentración plasmática de MDA y de los sistemas anti-oxidantes (Altomare y col., 1992).

Se ha reportado concentraciones altas de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBA) y triglicéridos (TG) en plasma de ratas con hígado graso (Kakkar y col., 1995). Sin embargo, el organismo ha desarrollado un sistema de defensa antioxidante para limitar la formación de los RL. Así, cabe mencionar enzimas como la catalasa (CAT), glutatión peroxidasa (GPx), superóxido dismutasa (SOD) y glutatión transferasa (GSH transferasa), que regulan la formación de ellos o pueden neutralizarlos una vez formados. También hay compuestos antioxidantes obtenidos en la dieta, tales como las vitaminas C y E y el ß- caroteno, capaces de capturar a los RL (Reiter 1996). Sobre la base de estos antecedentes la presente investigación tiene como objetivo: Determinar si la vitamina C tiene efecto hepatoprotector sobre el daño oxidativo y daño al ADN producido durante el desarrollo en ratones del hígado graso inducido por etionina.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

 

 

Diseño de Experimento

Este trabajo se realizó en la Unidad de Investigación en Ciencias Funcionales "Dr. Haity Moussatché" del Decanato de Ciencias Veterinarias de la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado (UCLA). Se desarrolló una investigación pura de tipo experimental de campo, donde se empleó un diseño longitudinal de evolución de grupo.

Se utilizaron 20 ratones hembras de la cepa NMRI no consanguíneos (Nacional Medicine Research Institute) provenientes del Bioterio Central de la UCLA y fueron mantenidas bajo condiciones estandarizadas de luz y temperatura. El agua y el alimento (Ratarina de Protinal, Valencia-Venezuela) fue suministrado ad libitum. El manejo en general se realizó siguiendo lo establecido en el Código de Ética para la Vida de la República Bolivariana de Venezuela (2010) en su segunda parte capítulo 3. Los animales fueron divididos en 4 grupos: 1) Grupo control (animales sin hígado graso), 2) Grupo hígado graso (HG), 3) Grupo hígado graso + vitamina C (HG +Vit C) y 4) Grupo Vitamina C (grupo testigo o control positivo, utilizado en todas las experimentaciones de este estudio).

A los animales del grupo 3 y 4 se les administro vías subcutánea 50 mg de Vit  C por cada 30g de peso vivo durante 30 días y a los controles solo agua destilada. Dos días antes de completar el tiempo de tratamiento con Vitamina C, a los animales del grupo 2  y 3, se les indujo hígado graso por inyección intraperitoneal de DL-etionina en dosis de7,5 mg/20g peso vivo y todos los grupos se sometieron a un ayuno por 48 horas (López y col., 1997). En forma simultánea se continuó con la aplicación del antioxidante en el caso del grupo 3 y 4 y con el agua destilada en el caso del grupo control. Finalizado el ayuno los ratones se sacrificaron bajo ligera eterización. El hígado de cada animal fue disecado y pesado (Balanza analítica Sauter, Alemania), se registró su aspecto macroscópico y se tomaron dos muestras, una para el análisis histopatológico y otra para realizar el homogeneizado del tejido.

 

Determinaciones Hepáticas

El homogenizado fue mantenido en hielo y en el sobrenadante se determinaron las concentraciones de: 1) Malondialdehido (MDA) por el Test para sustancias reaccionantes con el ácido 2-tío barbitúrico (TBARS) de acuerdo a la técnica de Ohkaway col (1979). 2) Dienos Conjugados (DC) mediante el método descrito por Camejo (1993), utilizando para la extracción, el isopropanol; ambas determinaciones son utilizadas como indicadores del grado de lipoperoxidación. 3) Triglicéridos hepáticos, mediante el kit comercial Qualitest basado en la técnica enzimática de Trinder (1973) con un estándar de 200 mg / dl de Trioleína. 4) Proteínas totales mediante el kit Bio Rad (Richmond, CA, USA) basado en el método de Bradford (1976). Se utilizó como estándar  una solución madre de 1,41 mg / ml de albúmina sérica bovina. 5) Daño al ADN hepático, se midió por el ensayo cometa de acuerdo a las técnicas  de Singh, 1998 y Tice 1995, con modificaciones según el protocolo de trabajo que sigue:

Se toma 1ml del homogenizado de hígado (control y experimental), se resuspende en 1 ml de PBS frio, con 500ml de EDTA 20mM y se colocan en dos tubos eppendorf en partes iguales. Se centrifuga a15.000 rpm, durante 5 minutos a 4ºC, se descarta el sobrenadante y se deja el pellet. Este pellet se resuspende con 500µl de PBS. Se prepara una lámina portaobjeto con agarosa de punto de fusión normal 0,5%, dejar solidificar durante 5 minutos a 4ºC. Se toman 50µl de muestra y se coloca en un eppendorf con 375µl de  agarosa debajo punto de fusión 0,5% y se deja solidificar durante 5 minutos a 4ºC. Se añade una tercera capa de agarosa (375 µl) debajo punto de fusión, dejar solidificar durante 5 minutos a 4ºC. Colocar sobre las láminas solución de lisis, durante1hora a 4ºC. Se lavan las láminas 3 veces con agua desionizada. Luego se incuban con solución alcalina, durante 20 minutos. Seguidamente colocar las láminas en una cámara horizontal y correr la electroforesis a 25 volt y 30 mA durante 20minutos.Se hacen tres lavados con buffer tris  para neutralizar. Posteriormente se lavan con agua destilada, se secan a temperatura  ambiente y se sumergen en etanol. Por último se tiñen con 80µl de bromuro de etidio durante30 minutos, se lava el exceso de colorante con agua destilada y finalmente se observa en el microscopio de fluorescencia con el filtro de exactitud de 515-560 y filtro de barrera de 590 nm.

Todas las mediciones espectrofotométricas se realizaron en un espectrofotómetro Genesys5 (Rochester NY, USA).

La muestra para el análisis histopatológico fue fijada en Formal bufferado al 10% y enviadas al Laboratorio de Patología del Decanato de Ciencias Veterinarias de la UCLA, para su posterior procesamiento y coloración con Hematoxilina-Eosina.

 

Análisis Estadístico

 

Los resultados fueron analizados en el paquete estadístico SPSS, versión 17.0 para Windows, mediante las pruebas ANOVA y comparaciones múltiples (DMS) (p≤0,05).

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

 

 

 

Cuantificación del  grado de hepatoesteatosis

 

El hígado graso es una enfermedad inflamatoria de origen metabólico de gran importancia por ser la segunda enfermedad hepática crónica, también se le conoce como esteatosis cuando hay infiltración (depósito) de grasa intrahepática y esteatohepatitis cuando además hay inflamación. Es una patología en la cual han sido involucrados los radicales libres, y en el HG inducido por etionina (ET) se observa un notable aumento de los radicales libres, indicativo de estrés oxidativo hepático (Aarsaether ycols., 1988; Lopez-Ortega y cols., 1997).

La etionina es un etil análogo de la metionina y compite con este aminoácido en las vías  metabólicas en que el participa. Inhibe la síntesis proteica en la célula hepática (Yokotay cols.,1982) y afecta la formación de las lipoproteínas del plasma; como consecuencia los lípidos que se acumulan en exceso.

Los resultados de este estudio, indican que los animales a quienes se les suministró etionina presentaron un aumento altamente significativo en la concentración de triglicéridos hepáticos (4,046±0,519) (p≤ 0.01) si se les compara con los animales tratados con etionina mas vitamina C (0,671±0,411). Por otro lado, la concentración de triglicéridos fue similar entre los animales del grupo que sólo recibió vitamina C (0,194± 0,008) y el grupo control (0,281±0,085). Siendo esta concentración mucho menor a la encontrada para los grupos que recibieron etionina (Figura1).

Cuantificación del estrés oxidativo hepático

 

Los cambios en el estado redox de la célula se pueden inducir principalmente por la presencia de radicales libres (RL), entendiéndose por radical libre a la especie que contiene uno o más electrones desapareados en su orbital más externo, condición que le confiere un considerable grado de reactividad con otras moléculas cercanas, a las cuales le sustrae o le cede algún electrón para lograr su estabilidad química (Halliwell y Gutteridge, 1984; Halliwell y Gutteridge, 1990; Valko y cols., 2004). Dentro de este contexto genérico, los RL se pueden formar a partir del oxígeno (especies reactivas del oxígeno, EROs) o del nitrógeno (especies reactivas del nitrógeno, ERNs). Para eliminar estas especies reactivas, los seres vivos poseen un conjunto de sistemas fisiológicos llamados sistemas antioxidantes (Sies y Cadenas, 1985; Halliwell, 1997), en donde la vitamina C o ácido ascórbico es un importante antioxidante, presente tanto en las células como en el plasma (Packer y cols., 1979).

Un incremento en la producción de RL y/o el descenso de la protección antioxidante, pueden inducir el denominado estrés oxidativo (EO) (Halliwell y Gutteridge, 1997). Este proceso oxidativo, provocado por cualquiera de estas causas, es una reacción en cadena de RL que buscan su estabilidad química, dañando proteínas, lípidos, carbohidratos y ácidos nucleicos. El daño oxidativo sobre los lípidos se conoce como lipoperoxidación (Halliwell y Gutteridge, 1984). Es en esta situación de EO en la que se manifiestan las lesiones que producen los RL (Sies y Cadenas, 1985; Davies, 1999) y la hepatoesteatosis es una de las patologías que se ha relacionado con un estado de EO (Lieber2001).

El proceso de lipoperoxidación puede ser evidenciado por los productos que se forman. Dentro de estos productos están los Dienos conjugados (DC) y el malondialdehido (MDA). El incremento en la liberación  de estos productos ocurre después de la formación de los radicales libres, lo cual indica que la lipoperoxidación es iniciada por los radicales libres del oxígeno.

 Los resultados de este estudio revelan un aumento de los niveles de MDA en el homogenizado de hígado del grupo HG (15,292±3,822) al compararlos con los obtenidos en los animales del grupo HG + VitC  (3,908±0,56), valor que es muy semejante a los obtenidos en el grupo control (4,786 ± 1,81) y en el grupo VitC (3,802 ± 1,28) (Figura 2). Asimismo, se determinaron los niveles de DC y se obtuvo un aumento en los animales con HG por etionina (422,82±91,63) al compararlos con el grupo HG + VitC, donde se encontró un valor inferior (336,06±91,63), aunque no llegaron a ser igual al valor medio obtenido en el grupo de animales controles (213,82±22,01), si se observa un menor daño que en el grupo HG (Figura3).

 Estos resultados concuerdan con los obtenidos anteriormente en nuestro laboratorio, donde se obtuvo  una disminución de los niveles de DC, en animales con HG inducido con etionina, los cuales fueron pre-tratados con melatonina, un potente antioxidante e inmunomodulador endógeno (López y col., 1997).             

                                                                

Histopatología

 

Macroscópicamente se puedo observar un evidente cambio de coloración en el hígado extraído de animales con HG inducido por etionina (Figura 4C) al compararlos con los obtenidos de animales con hígado normal (Figura4A).También se evidencia una franca recuperación del color normal del hígado en animales pre tratados con Vit C (Figura4B).

 

          Las muestras de hígado fueron fijadas en solución de formol al 10% y enviadas al Laboratorio de Patología del Decanato de Ciencias Veterinarias de la Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado” para su estudio histopatológico. La tinción usada fue hematoxilina-eosina, se determinó la cuantía de hígado graso sobre la base del contenido de vacuolas lipídicas presentes en el tejido.

Este estudio revela que en el tejido  hepático de ratones sin el tratamiento con etionina, las células conservan sus características dentro de lo normal y la arquitectura del parénquima hepático mantiene la uniformidad.(Figura 5A).

En la muestra tomada de hígado de ratones con tratamiento con etionina se puede observar metamorfosis grasa hepática severa. En algunas zonas se presenta ruptura de los hepatocitos, vacuolizados, con coalescencia, formando microquistes lipídicos, por lo que se reporta como hígado graso, debido a la infiltración de estos lípidos (Figura 5B).

El resultado obtenido del estudio histológico del hígado proveniente de ratones con 30 días de tratamiento con VitC, revela que el patrón celular tiende a conservar los parámetros normales del tejido hepático (Figura5C). Lo que indica el efecto protector de este antioxidante.

 Existen reportes que indican que las bajas concentraciones endógenas de antioxidantes están asociadas a un incremento de la generación de RL que conlleva a la generación de HG y a EO, presentándose también en casos  más severos una respuesta inflamatoria sistémica con un aumento en la morbilidad y mortalidad en pacientes críticos (Perez y col., 2006)

 Nuestro grupo de investigación ha estudiado el efecto protector de antioxidantes como la Vit E, la melatonina y en este caso la Vit. C, haciendo aportes de importancia en busca de soluciones ante esta patología.

 

 

 

Medición del daño al ADN

 

 

Como fue mencionada anteriormente, el desbalance entre la producción de RL y los mecanismos de defensa antioxidante genera estrés oxidativo. El estrés oxidativo leve puede llevar a la célula a tener más resistencia para injurias posteriores producto de una buena regulación de los sistemas de defensa antioxidante. Por el contrario, si el estrés oxidativo es muy intenso, el daño oxidativo afectaría a todos los componentes de la célula (ADN, lípidos y proteínas).

Heaton y cols. (2002), observaron en gatos que la reducción del daño endógeno de ADN a través del enriquecimiento de la dieta con antioxidantes como la Vit C, puede reducir la susceptibilidad a padecer enfermedades degenerativas, incluyendo el proceso de envejecimiento, a través de la reducción del daño y capacidad de reparación del ADN.

En este estudio se determinó el daño al ADN hepático en ratones con hígado graso causado por etionina, a través de la teénica del ensayo cometa, cuyo fundamento se basa en la capacidad de los fragmentos de ADN para ser embebidos en un gel de agarosa y responder a un campo eléctrico. La corrida del extendido de DNA depende directamente del daño del DNA presente en las células. Es importante mencionar que las lesiones al DNA consisten en rotura de las cadenas después del tratamiento con álcalis o sin éste e incluso de la combinación con ciertas enzimas, lo que incrementa la migración de DNA.

En este estudio no se pudo hacer una medición nítida de la cola del cometa, sin embargo se pudo evidenciar claramente, a través de las imágenes obtenidas, la irregularidad del núcleo de los hepatocitos pertenecientes a los animales que desarrollaron hígado graso (Figuras 6B y 6C) al compararlas con los del grupo control (Figura6A), y con los del grupo de ratones pre-tratados con Vitamina C (Figura 6D).

 

 

 

 

CONCLUSIONES:

 

En este estudio se pudo evidenciar que el grupo de animales que fueron pre-tratados con vitamina C no desarrollaron el hígado graso como sucedió con el grupo que no se le suministró vitamina C. Este efecto fue evidenciado por una disminución en el daño oxidativo causado por los radicales libres y determinado a través de la cuantificación de la lipoperoxidación (niveles de Dienos Conjugados y MDA) y del daño del ADN. Por estas razones podemos inferir que la vitamina C es un efectivo antioxidante y es un protector del hígado ante la producción permanente de radicales libres, generadas por diversas fuentes y que además es efectivo en la reparación y conservación del ADN.